Đại cương lên men
Định nghĩa lên men
Lên men là một phản ứng hóa học được thực hiện bởi vi sinh vật, nhờ quá trình này mà các phân tử carbohydrat như tinh bột hoặc glucose được phân cắt và phá hủy. Lên men có rất nhiều lợi ích cho sức khỏe con người và được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm như nước uống có cồn, bánh mì, sữa chua, dưa chua, giấm táo… Nó cũng được sử dụng trong công nghiệp như sản xuất ethanol như một nguồn năng lượng sinh học.
Ưu nhược điểm công nghệ lên men
Ưu điểm: Sử dụng các vi sinh vật với kích thước nhỏ, tỉ lệ bề mặt trên thể tích lớn, do đó hấp thu dược chất rất nhanh. Các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng mạnh chu kỳ ngắn do dó tốc độ đồng nhất hóa cao, sinh sản nhanh, nhanh sản xuất sản phẩm. Dễ thích nghi, do vi sinh vật dễ dàng tiếp nhận một vật liệu di truyền nào đó để thích nghi với điều kiện môi trường sống. Sản xuất ít phụ thuộc môi trường thời tiết. Tốn ít diện tích (chỉ cần một nồi lên men). Tận dụng được các phế phẩm và nguyên liệu nuôi cấy. Như các vi tảo có khả năng sử dụng các nguyên liệu từ dầu mỏ, khí CO2… Phát triển được ở nhiệt độ và áp suất thường. Có thể thực hiện được nhiều phản ứng hóa sinh khác nhau, do một vi sinh vật có chứa rất nhiều enzym. Như đã đề cập, các vi sinh vật rất dễ tiếp nhận các vật liệu di truyền mới, cũng như dễ dàng thực hiện các phương pháp biến đổi gen như đột biến, tái tổ hợp để tăng sản lượng hoặc biến đổi các sản phẩm cuối. Có khả năng tạo ra sản phẩm đối quang mong muốn và có hoạt tính- những sản phẩm này rất khó để thực hiện bằng các phản ứng hóa học. Điện hình là việc sản xuất các acid amin như glutamic, aspamat…
Nhược điểm: Do dễ dàng thay đổi kiểu gen, nên các vi sinh vật này cũng rất dễ biến dị và hồi biến tính hoang dại. Có thể gây ra các độc tính cho người dùng. Quá trình sản xuất phức tạp và đòi hỏi độ vô trùng cao. Chỉ cần nhiễm một vi khuẩn hay một virus khác, nguy cơ hỏng quá trình lên men là rất cao do các tạp nhiễm, các độc tố mà vi sinh vật tạp nhiễm này gây ra. Cần tiến hành bảo quản và giữ giống trong thời gian dài, tăng chi phí.
Các phương pháp lên men
Theo điều kiện hô hấp
Dựa vào đặc điểm hô hấp của vi sinh vật để chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp: Lên men kị khí: áp dụng cho với các vi sinh vật kỵ khí (không tiếp xúc với O2); quá trình nuôi cấy này không cần cung cấp không khí cho vi khuẩn. Có thể thực hiện nên men trên môi trường lỏng hoặc bán rắn. Một số ví dụ của quá trình lên men kị khí như lên men rượu, lên men vitamin B12, muối dưa. Hình ảnh: Lên men rượu Lên men hiếu khí: áp dụng với vi sinh vật hiếu khí, quá trình nuôi cấy cần cung cấp không khí sạch có O2 để vi sinh vật hô hấp. Môi trường lên men có thể là lỏng hoặc bán rắn. Các sản phẩm được sản xuất từ lên men hiếu khí như dấm, mốc tương, sản xuất penicillin từ nấm mốc. Lên men vi hiếu khí: áp dụng đối với các vi sinh vật vi hiếu khí, cần cấp khí nhẹ trong quá trình lên men. Thực hiện nuôi cấy các vi sinh vật này trong môi trường lỏng. Ví dụ điển hình của quá trình này là sản xuất vitamin B12 (cần cấp khí giai đoạn sau để vi sinh vật có O2 tổng hợp sản phẩm).
Theo hình thức thiết bị
Dựa vào bề dày và thể chất của môi trường để phân loại:
Lên men bề mặt dịch thể: áp dụng cho nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí, thực hiện ở môi trường lỏng, bề dày môi trường nuôi cấy mỏng, bề mặt tiếp xúc với không khí rộng. Trong quá trình nuôi cấy cần cấp khí vô trùng và làm mát.
Ưu điểm: đơn giản, dễ tiến hành, khi có sự cố ở một vài thiết bị nuôi cấy có thể dễ dàng loại bỏ.
Nhược điểm: Khó giữ được độ vô trùng do bề mặt thoáng của nó rất rộng, cấp khí trong quá trình nuôi cấy nên rất khó để kiểm soát. Khó cơ giới hóa và tự đồng hóa. Tốn diện tích do lên men bề mặt có bề mặt thoáng lớn và có bề dày môi trường nhỏ, nên cần không gian rộng để xếp các dụng cụ nuôi cấy này. Tốn nhân công do cơ giới hóa kém, nhiều bình nuôi cấy khác nhau nên cần nhiều nhân lực để kiểm soát và vận hành. Sản phẩm thu được không đồng nhất, do được nuôi cấy trên nhiều thiết bị khác nhau, khó kiểm soát được độ đồng đều về hàm lượng vi sinh vật, dinh dưỡng, không khí và sản phẩm tạo thành giữa các thiết bị.
Lên men bề mặt rắn: áp dụng với các vi sinh vật hiếu khí. Môi trường nuôi cấy ở dạng lỏng hoặc bán rắn. Có thể sử dụng các chất dinh dưỡng không tan như tinh bột và sử dụng các chất làm tăng độ xốp từ các loại hạt, mảnh, phế liệu hữu cơ, bã mía. Trong quá trình nuôi cấy, trước tiên cần hồ hóa tinh bột (độ ẩm từ 60 đến 75%), bổ sung các chất dinh dưỡng, các chất khoáng và vi lượng… Bề mặt rắn có ưu điểm rẻ hơn bề mặt lỏng do các thành phần dinh dưỡng rẻ hơn, tận dụng được nhiều nguyên liệu phế thải. Trong quá trình nuôi cấy cần cung cấp không khí vô trùng như với lên men bề mặt dịch thể.
Ưu điểm: Tiến hành đơn giản, có thể tiến hành nuôi cấy đồng thời nhiều vi sinh vật (khác biệt với dịch thể) (ví dụ lên men rượu, bột men rắc lên cơm là hỗn hợp nhiều vi sinh vật nuôi cấy, các vi sinh vật trong môi trường sẽ phân giải tinh bột để tạo thành các glucose, sau đó nấm men mới sử dụng để tạo ethanol. Dễ tiến hành sử lý cục bộ: trong cùng bình nuôi cấy hoặc giữa các bình. Do bề mặt rắn lên dễ dàng khu trú những vùng bị hỏng và loại đi không để chúng lan ra toàn bộ thiết bị.
Nhược điểm: cũng giống như thiết bị lên men bề mặt dịch thể, phương pháp này khó giữ được độ vô trùng (do diện tích tiếp xúc rộng), khó cơ giới hóa tự động hóa và tốn diện tích nhân công.
Ở dưới thiết bị nuôi cấy, vi sinh vật khó hô hấp, ảnh hưởng đến nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí do đó môi trường cần xốp và có bề dày thích hợp. Hiện nay có một số cá tiến được áp dụng như thiết bị nuôi cấy có thêm cánh đảo hoặc bị quay để tăng quá trình đảo trộn giúp vi sinh vật tiếp xúc với không khí và dinh dưỡng tốt hơn nhưng vẫn phải đảm bảo điều kiện vô trùng tốt.
Lên men chìm: thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng, môi trường nuôi cấy dày. Chúng có thể áp dụng cho cả lên men vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí.
Ưu điểm: Áp dụng được gần như mọi loại vi sinh vật. Với vi sinh vật hiếu khí tiến hành cấp khí vào môi trường lỏng (nhưng là từ dưới lên chứ không phải từ bề mặt như 2 phương pháp trên) còn vi sinh vật kỵ khí thì không cần. Tốn ít diện tích vi sinh vật chỉ cần nuôi cấy trong một thiết bị với thể : tích lớn, diện tích mặt thoáng nhỏ. Do chỉ cần một thiết bị, mặt thoáng nhỏ nên việc kiểm soát độ vô trùng tốt hơn, dễ dàng kiểm soát được toàn bộ quy trình. Dễ dàng kiểm soát bằng các máy móc và thiết bị, do đó ít cần sử dụng nhân lực hơn. Đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm, (do chúng cùng được thu từ một thiết bị).
Nhược điểm: thiết bị đắt tiền, phức tạp, cần có cán bộ chuyên môn vận hành. Do là môi trường lỏng và chỉ có một thiết bị, nên nếu xảy ra sự cố như nhiễm khuẩn, vi sinh vật bị chết có thể sẽ làm hỏng cả lô sản phẩm.
Các thiết bị sử dụng trong lên men bề mặt như bình nón (với quy mô phòng thí nghiệm) đến các bình fermentor trong quy mô công nghiệp.
Hình ảnh: Thiết bị lên men Fermentor
Theo cách tiến hành
Tùy thuộc chế độ cung cấp nguyên liệu và thu sản phẩm mà có các phương pháp khác nhau.
Lên men mẻ gián đoạn: phương pháp này tiến hành theo các lô, mẻ. Chỉ cung cấp dinh dưỡng trước nuôi cấy và thu sản phẩm ở cuối quy trình. Khi được nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp như dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, các vi sinh vật sẽ phát triển theo đúng chu kỳ gồm 5 giai đoạn từ tiềm tàng, nhân lên chậm, sinh trưởng mạnh (logarit), giai đoạn cân bằng và suy vong. Do hầu hết các thông số quy trình không thay đổi, nên phương pháp này rất thích hợp với các phẩm chuyển hóa bậc 2 (đồi hỏi điều kiện nghiêm ngặt và ổn định, nếu thay đổi điều kiện môi trường sẽ không tạo ra sản phẩm nữa).
Ưu điểm: chi phí ban đầu thấp, dễ dàng nâng quy mô bằng các mô hình toán học. Có thể tiến hành sản xuất với quy mô lớn với nồi lên men trên 1000 lít).
Nhược điểm: Hiệu suất thấp hơn các phương pháp khác, do vi sinh vật sẽ phát triển theo đúng chu kỳ sinh trưởng, sản phẩm chỉ thu trong một thời điểm nhất định. Không lý tưởng với các sản phẩm bậc 1 Có sản xuất theo các lô mẻ, nên nếu có thay đổi nhỏ về các thông số và môi trường nuôi cấy, sẽ rất khó để bảo đồng nhất giữa các mẻ. Cần tiến hành khử trùng ở môi mẻ, lô sản xuất, khử trùng nhiều lần như vậy sẽ khiến các bộ phận như cảm biến oxy, đo pH, nhiệt kế, áp suất thẩm thấu nhanh lão hóa, dẫn đến tăng chi phí sản xuất.
Lên men bán liên tục: định kỳ bổ sung chất dinh dưỡng và thu sản phẩm không chứa tế bào hoặc thu sản phẩm cuối quy trình. Quy trình này được áp dụng trong sản xuất các sản phẩm cuối cùng hoặc các sản phẩm bậc 1. Việc bổ sung môi trường dinh dưỡng định kỳ gây thay đổi thể tích môi trường nuôi cấy, thay đổi các đặc điểm về nhiệt độ, dinh dưỡng nên không thích hợp với các sản phẩm bậc 2.
Ưu điểm: Việc bổ sung dinh dưỡng giúp giảm độ nhớt môi trường nuôi cấy làm thuận tiện cho các quá trình chuyển khối và vi sinh vật hấp thu dinh dưỡng tốt hơn. Môi trường được pha loãng còn làm giảm ức chế của tế bào với các sản phẩm phụ hoặc bản thân sản phẩm chính của nó. Ví dụ, trong quá trình lên men rượu nấm men bị ức chế ethanol, do đó, chỉ một thời gian, khi nồng độ ethanol đã đạt quá mức làm nấm men không thể tiếp tục sản xuất ethanol được nữa dù môi trường nuôi cấy vẫn rất dồi dào, dẫn đến làm giảm hiệu suất quá trình. Còn trong lên men bán liên tục, môi trường được pha loãng bởi dinh dưỡng và thu sản phẩm định kỳ, giúp nấm men sản xuất ethanol một cách liên tục.
Nhược điểm: Như đã nói ở trên, việc bổ sung sẽ làm không ổn định môi trường nuôi cấy cả về dinh dưỡng và sản phẩm. Do đó, cần tiến hành kiểm soát và lấy mẫu thường xuyên để kiểm tra nồng độ cơ chất và sản phẩm tạo thành. Việc cấp dinh dưỡng và thu sản phẩm định kỳ cũng làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn trong môi trường nuôi cấy, tăng rủi ro nhiễm khuẩn.
Phương pháp lên men liên tục:
Đặc điểm: quá trình này đặc trưng bởi một cân bằng động giữa việc cấp dinh dưỡng vào và thu sản phẩm một cách liên tục. Do đó, môi trường nuôi cấy có thể tích không thay đổi. Việc thay đổi này, cũng giống như lên men bán liên tục, gây ra các thay đổi sinh lý của vi sinh vật. Nhờ việc cung cấp dinh dưỡng và thu sản phẩm liên tục, vi sinh vật sẽ có khả năng kéo dài được pha cân bằng, điều này rất thuận lợi để thu được nhiều sản phẩm. Phương pháp này cũng chỉ cần tiến hành với những nồi lên men nhỏ quy mô dưới một 1000 Lit trong sản xuất công nghiệp.
Ưu điểm: Như đã nói ở trên, phương pháp này kéo dài pha cân bằng, do đó tế bào lấu già hóa hơn. Trạng thái sinh lý của tế bào đồng nhất hơn lên men mẻ, tạo được sản lượng ổn định hơn. Do kéo dài được pha cân bằng, quá trình sản xuất sản phẩm sẽ được kéo dài hơn, do đó giảm được chi phí nhân lực và các khâu nhân giống. Ngoài ra, thiết bị lên men nhỏ hơn và sản phẩm thu dần dần nên giảm độ phức tạp cho quá tiệt trùng và thu sản phẩm. Do được tiến hành liên tục, dinh dưỡng và sản phẩm cũng như các điều kiện khác được giữ hằng định, nên tính đồng nhất của sản phẩm thu được sẽ đồng nhất hơn lên men nhiều lô mẻ. Lượng dinh dưỡng được sử dụng nhiều hơn (do kéo dài pha cân bằng), tổng lượng sản phẩm cũng thu được nhiều hơn giúp hiệu suất của quy trình tăng.
Nhược điểm: Do liên tục được lấy ra và pha loãng bởi môi trường, nên sản phẩm thu được không phải là dạng đặc nhất Tương tự như lên men bán liên tục, việc cấp và thu sản phẩm giữa quá trình nuôi cấy làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn. Do đó, cần tăng kiểm soát quy trình dẫn đến tăng chi phí. Làm thay đổi sinh lý tế bào (kéo dài pha cân bằng), do đó cần tính toàn lại các thống số và chất lượng giữa các đợt lên men. Việc thu sản phẩm định kỳ cũng là một nguy cơ gây thất thoát giống và sinh khối. Quy trình này chưa được phổ biến trong công nghiệp và gây khó khăn khi năng cấp quy mô sản xuất.
Thiết bị trong quá trình lên men
Theo hình thức, thiết bị được chia thành thiết bị lên men bề mặt (dạng rắn hoặc lỏng) và thiết bị lên men chìm.
Thiết bị lên men bề mặt dịch thể: thưởng sử dụng các lọ hở hoặc kín. Ưu điểm của nó là cấu tạo đơn giản, rẻ. Tuy nhiên, khả năng đảm bảo vô trùng kém, không đồng nhất lô mẻ và tốn diện tích. Penicillin trước đây được sản xuất nhờ thiết bị này.
Thiết bị lên men bề mặt bán rắn: sử dụng các thiết bị dạng khay, thùng quay hoặc đĩa quay. Dạng khay: cũng tương tự như các chai lọ, nó cần nhiều diện tích. Trong môi trường nuôi cấy cần có thêm chất tạo xốp để vi sinh vật tiếp xúc oxy. Dạng thùng quay: là biến thể của dạng khay. Chuyển động quay mà môi trường được phân tán đồng đều, do đó vi sinh vật phát triển tốt hơn, tiếp xúc nhiều với dinh dưỡng và không khí. Trong thùng quay có thể lắp thêm các cánh đảo, để tăng khả năng đảo trộn. Các thùng quay còn ưu điểm là có thể xếp chồng các khay lên nhau giúp giảm diện tích môi trường nuôi cấy.
Thiết bị lên men chìm: Với quy mô phòng thí nghiệm có thể sử dụng bình nón: Bình nón có ưu điểm là phần dưới có kích thước lớn hơn do đó dễ dàng cung cấp oxy cho vi sinh vật hô hấp, và khi lắc, oxy dễ dàng hòa tan vào môi trường. Hình ảnh: Bình nón Với quy mô công nghiệp sử dụng thiết bị fermentor: thiết bị này được làm từ thủy tinh và thép không gỉ do đó rất dễ vệ sinh và hạn chế được vi sinh vật bám vào gây tạp nhiễm. Thiết bị này có nhiều loại kích thước để phù hợp với từng quy mô nghiên cứu hay quá trình nhân giống (từ 5- 10 lít: thích hợp với phòng thí nghiệm; từ 50 đến 500 lít: thích hợp với quy mô pilot; và từ 1000 lít trở lên có khi đến hàng triệu lít…phù hợp với quy mô công nghiệp). Trong thiết bị này có bộ phận khuấy trộn, hệ phân tán khí vô trùng, hệ thống áo nước bên ngoài (duy trì nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật phát triển), hơi nước để tiệt trùng… nên rất thuận tiện cho quá trình nuôi cấy và kiểm soát trong quy trình.
Các giai đoạn quá trình lên men
Quá trình lên men gồm 3 giai đoạn chính là trước lên men, trong lên men và sau lên men.
Trước lên men
Cần thực hiện việc chuẩn bị giống, chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, thiết bị; và tiến hành khử trùng.
Chuẩn bị giống: giống phải đạt các tiêu chuẩn để tiến hành lên men. Việc này phải tùy vào mục đích sản xuất sản phẩm cuối như protein đơn bào, probiotic, acid amin, ….Nhưng chúng đều phải có nguồn gốc rõ ràng và phải được phân loại đến cấp chủng.
Giữ giống: giống chưa nuôi cấy cần được giữ trong môi trường thạch, trong cát đất, hạt ngũ cốc, silicagel, đông khô… Các biện pháp này phải đảm bảo giữ được hoạt tính và không làm chết vi sinh vật.
Giữ giống trong môi trường thạch
Hoạt hóa giống: cần tiến hành kiểm tra độ thuần khiết và kiểm tra khả năng hồi biến tính hoang dại. Sau đó tiến hành kích thích tế bào vi sinh vật.
Chú ý: không được sử dụng giống từ một nồi lên men đã kết thúc lên men để làm giống cho mẻ sản xuất tiếp theo do các vi sinh vật này đã già (đến pha suy tàn), khả năng sinh trưởng cũng như sinh sản phẩm là rất thấp.
Môi trường dinh dưỡng: yêu cầu phải cung cấp đủ chất dinh dưỡng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển và tạo sản phẩm của vi sinh vật. Về cơ bản, môi trường nuôi cấy gồm các thành phần như nguồn hydrocarbon, nguồn nitơ, nguồn phospho, vi lượng, vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, dầu phá bọt và các tiền chất: Nguồn hydrocarbon: Đây là nguồn năng lượng lớn nhất cho vi sinh vật. Chúng tiêu thụ từ 10 đến 50% nguồn này trong chu kỳ sinh trưởng. Nguồn này gồm có 2 dạng là dạng tan được như glucose, saccarose…- các đường này vi sinh vật rất dễ đồng hóa và các dạng không tan như tinh bột (gồm ngô, lúa mì, gạo, sắn…)- vi sinh vật phải có amylase mới có thể tiêu hóa được. Ngoài ra còn có thể sử dụng một số nguồn khác như cellulose (từ rơm rạ, bã mía..) hoặc dầu mỏ như methan, parafin (từ C8 đến C18). Nguồn N2: ngoài cung cấp năng lượng, nguồn này còn cung cấp các nhóm amin cho acid amin, acid nucleotid cần thiết để vi sinh vật nhân lên và tạo sản phẩm. Các nguồn nitơ gồm có nguồn vô cơ như amoni, và muối nitrat và nguồn hữu cơ như acid amin trong bột đậu, bột ngô, cao nấm men, pepton và cao thịt. Ngoài ra trong cao ngô còn có thêm các chất kích thích sinh trưởng và các nguyên tố vi lượng, nên nguồn này được sử dụng rất phổ biến. Phospho: phospho là thành phần cấu tạo lên nhiều thành phần của tế bào như các acid nucleotid, các enzym. Cũng như nguồn nitơ, nguồn phospho có thể ở dạng hữu cơ hoặc vô cơ. Với các muối KH2PO4, K2HPO4 (vô cơ); bột đậu, ngô (nguồn hữu cơ)… Canxi: hay sử dụng là CaCO3, vì chúng còn có khả năng duy trì Ph môi trường do các acid béo của vi sinh vật tiết ra. Các nguyên tố vi lượng: bổ sung thêm các nguyên tố thiết yếu cho vi sinh vật phát triển như magie, đồng, mangan, kẽm… Các nguồn này có thể được bổ sung từ các muối vô cơ hoặc chính từ các nguồn nguyên liệu hydrocarbon và nito hữu cơ. Vitamin và chất kích thích sinh trưởng: cần thiết cho các quá trình trao đổi chất và nhân lên của vi sinh vật. Các thành phần này có thể được bổ sung riêng lẻ hoặc từ các nguồn dinh dưỡng như cao ngô hoặc rỉ đường. Dầu phá bọt: được sử dụng để phá bọt sinh ra trong quá trình nuôi cấy (do khuấy trộn hoặc do cấp khí với vi sinh vật hiếu khí). Thường sử dụng dầu thực vật để phá, nguồn này cũng có thể trở thành nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Tuy nhiên, khi sử dụng với lượng quá lớn, nó có thể tạo thành nhũ tương và cản trở quá trình trao đổi khí hoặc dinh dưỡng của vi sinh vật. Tiền chất: một số sản phẩm tạo thành cần có thêm tiền chất để gắn vào sản phẩm của vi sinh vật. Ví dụ như trong sản xuất kháng sinh penicillin, cần bổ sung thêm các gốc R để tạo kháng sinh mong muốn, hoặc như tổng hợp vitamin B12, cần 5,6 DMB bổ sung vào công thức. Thông thường được sử dụng với nồng độ thấp (mcg/L) và trong những khoảng thời gian nhất định. Khử trùng: gồm khử trùng thiết bị, môi trường nuôi cấy, nước… Quá trình khử để tiệt khuẩn môi trường dinh dưỡng, với dung nhiệt nó còn giúp hồ hóa các thành phần tinh bột trong môi trường.
Phương pháp tiệt khuẩn hay được áp dụng là nhiệt ẩm: với nhiệt độ 121 độ C trong 30 phút, ở áp suất 0.6 đến 1 atm.
Chú ý: khi tiến hành khử trùng không khí, cần qua các hệ thống sử lý độ ẩm và tạp tiểu phân.
Trong lên men
Gồm 2 quá trình là nhân giống và lên men.
Nhân giống: quá trình nhân giống làm tăng số lượng tế bào ở giai đoạn đoạn sinh trưởng (phát triển mạnh nhất), do đó chỉ nuôi trong một thời gian ngắn. Giai đoạn này, còn giúp vi sinh vật quen với môi trường nuôi cấy (thường là dịch thể trong lên men chìm).
Khi tiến hành nhân giống, cần căn cứ vào thể tích thiết bị lên men, thể tích nồi nhân giống cuối thường bằng 10% so với thể tích tổng (có thể từ 5 đến 20%). Nếu tỉ lệ quá nhỏ, vi sinh vật sẽ khó quen với lượng dinh dưỡng quá lớn, không kịp để tiêu thụ hết dinh dưỡng đã đến pha suy tàn, làm hiệu suất giảm. Còn tỉ lệ quá cao, lượng dinh dưỡng không đủ, chưa kịp tạo sản phẩm đã hết dinh dưỡng.
Để vi sinh vật quen với thiết bị lên men, quá trình nhân giống cuối cùng cần được tiến hành trong thiết bị có hình dạng tương tự thiết bị lên men.
Lên men: đây là giai đoạn quan trọng nhất vì nó tạo ra sản phẩm và tăng sinh khối. Quá trình này tiến hành cung cấp không khí, chất dinh dưỡng, truyền nhiệt, chuyển khối và điều chỉnh các phản ứng sinh học thích hợp như bổ sung môi trường dinh dưỡng, điều chỉnh pH và phá bọt. Thời gian tiến hành giao động từ 24h đến 120 giờ tùy thuộc vào sản phẩm đích muốn thu hoạch.
Hiệu suất của quá trình này sẽ phụ thuộc vào độ vô trùng, thành phần dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, cấp khí, thời gian nuôi cấy, chất tiền thể.
Quá trình khuấy trộn: Giúp ngăn cản sự kết tụ và sa lắng giữa các tế bào trong quá trình nuôi cấy, tăng tiếp xúc vi sinh vật với dinh dưỡng và không khí. Giảm tập trung cục bộ sản phẩm chính và sản phẩm phụ trong quá trình, làm ức chế việc sinh tổng hợp vi sinh vật. Cần chú đến tốc độ khuấy trộn trong quá trình. Khi khuấy trộn với tốc độ quá cao, các tế bào va đạp mạnh có thể gây vỡ, tổn thương hoặc tạo các hệ sợi, các pellet đặc chắc và nhỏ- pellet càng đặc, tiếp xúc đồng đều giữa các vi sinh vật với dinh dưỡng càng kém. Tuy nhiên, khi khuấy quá nhẹ, việc đồng đều oxy và chất dinh dưỡng khó đạt được.
Quá trình cấp khí: quá trình đặc biệt quan trọng với vi sinh vật hiếu khí.
Nhu cầu oxy là khác nhau giữa các vi sinh vật, lượng sinh khối trong nồi lên men, và dung tích thiết bị nuôi cấy. Tốc độ cấp khí được đo bằng thông số V/V/M hoặc g/l/h…
Quá trình phá bọt: bọt sinh ra trong quá trình lên men do khuấy trộn và sục khí. Khí bọt này tạo ra lượng quá lớn có thể trào ra các đường ống và dễ dẫn đến tạp nhiễm và khó khăn khi vệ sinh bảo trì. Bọt sinh ra nhiều cũng cản trở việc tiếp xúc của các tế bào vi sinh vật với môi trường dinh dưỡng. Do đó cần tiến hành phá bọt trong lên men. Các phương pháp xử lý bọt như sử dụng các chất diện hoạt, các dầu thực vật, mỡ cá heo. Yêu cầu của các chất phá bọt này có khả năng nhanh chóng phân tán bọt, không gây độc được với vi sinh vật có tác dụng kéo dài và chỉ cần sử dụng với một lượng nhỏ là có tác dụng.
Điều chỉnh pH: mỗi vi sinh vật chỉ phát triển trong một điều kiện pH nhất định, pH ảnh hưởng đến tỉ lệ các ion H+ và OH- trong môi trường mà các ion này ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt lực của các enzym và chất keo trong tế bào (thành phần quan trọng đối với sự sống còn của vi sinh vật) do đó cần ổn định pH trong quá trình lên men. Các biện pháp ổn định pH thường dùng là các chất hệ đệm như đệm phosphat, đệm amoni hoặc các chất kiềm nhẹ như CaCO3.
Hình ảnh: Bột CaCo3
Điều chỉnh nhiệt độ: cũng như pH các vi sinh vật cũng chỉ hoạt động và sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ nhất định- do nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym. Đặc biệt trong quá trình lên men, các quá trình như khuấy trộn, sục khí hay sự hô hấp của vi sinh vật đều là quá trình tỏa nhiệt, làm thay đổi nhiệt độ môi trường nuôi cấy. Do đó, cần có các thiết bị để kiểm soát và điều khiển nhiệt độ thích hợp.
Ngoài ra, trong quá trình lên men cũng thường xuyên tiến hành quá trình lấy mẫu để xác định pH môi trường, hàm lượng dinh dưỡng, độ vô trùng, hàm lượng sản phẩm, trạng thái của vi sinh vật. Từ đó, tiến hành các biện pháp giải quyết kịp thời và xác định được thời gian thu sản phẩm thích hợp.
Quá trình thu sản phẩm
Tùy thuộc sản phẩm ở trong nội bào hay ngoại bào mà tiến hành các thu sinh khối hay thu dịch lọc. Với sản phẩm nội bao ta tiến hành thu sinh khối còn ngoại bào thì thu dịch lọc. Một số sản phẩm còn tồn tại cả trong và ngoài tế bào, do đó cần thu toàn bộ khối sau lên men.
Tiến hành tách sinh khối và dịch lên men: có thể sử dụng ly tâm hoặc lọc (lọc trống hay khung bản- ưu tiên sử dụng vì lọc được các dịch nhớt cao) và mới nhất là lọc tiếp tuyến.
Quá trình này nên tiến hành ở nhiệt độ thấp khoảng 4 độ C để giữ được hoạt tính của tế bào cũng như các thành phần khác. Trong quá trình lọc, có thể sử dụng các chất trợ lọc là các chất có cấu trúc xốp, hấp phụ được các tế bào, trành để các tế bào này nến chặt trên bề mặt màng lọc và cản trở quá trình di chuyển của dịch.
Với sản phẩm nội bào cần tiến hành tiếp quá trình phá hủy tế bào để giải phóng dược chất. Có thể sử dụng acid hoặc kiềm để phá hủy màng tế bào và giải phóng chất nội bào ra ngoài. Tiến hành lọc để thu được dịch nội bào.
Chiết tách sản phẩm: dịch thu được sau lọc sẽ được chiết bằng dung môi hữu cơ, sử dụng các nhựa trao đổi ion hay nhựa hấp phụ để thu được sản phẩm. Có thể chuyển dạng muối hoặc dạng kết tủa thích hợp.
Tinh chế: sản phẩm thô thu được sẽ tiếp tục tinh chế để loại tạp, tẩy màu, sau đó được kết tinh lại tạo sản phẩm.
